Abstract
In recent years, human activities and climate change have caused strong impacts on our ecosystems. This has fostered an increasing interest in studies able to determine the possible fates of our ecosystems. Generally, these studies are based on the use of ecosystems able to offer a perspective of future scenarios, starting from data based on cause/effect relationships that environments have been facing in different moments of their existence. Alpine arc is one of the most impacted areas by global warming. Nevertheless, a few paleoclimatic studies have been conducted, mainly in glacier areas. In addition, these studies are based on the morphological identification of organic residues that are timeconsuming and require high taxonomic expertise. With this regard, here we propose a multiproxy approach including morphological and DNA-based techniques to investigate Alpine peatlands as natural paleoclimatic archives. The objective of this thesis is therefore twofold: i) to evaluate the use of biomolecular techniques such as environmental DNA metabarcoding for the taxonomic identification of organic residues in peatland environments, to reduce the time of analysis and free these studies from experience required by the morphological identification; ii) to perform the first palaeoecological reconstructions through a multi-proxy approach of three peatland sites located in the Adamello Natural Park. To achieve these objectives a review of the literature was conducted to describe the main techniques used so far, highlighting their limitations, and describing how molecular techniques can not only help to overcome these limitations but also how it can include in the studies organisms excluded from palaeoecological reconstructions due to difficulties in their identification. Next, an experimental study was conducted to compare the use of the DNA metabarcoding approach with the classical geochemical and morphological analyses. A core from a peatland site - Wölflmoor (Bolzano - Italy) - sampled in 2017 was considered. The chloroplastidial intron trnL(UAA) and a portion of the cytochrome-c oxidase (CO1) subunit 1, which can amplify plant and invertebrate DNA, respectively, were selected as molecular markers. In addition, classical morphological identification of pollen, plant macrofossil, amoebae, and measurement of bulk density, water content and C/N ratio were also conducted. 2 The results obtained showed that the DNA analysis was able to confirm the trends highlighted in the other proxies, although presenting limitations related to the taxonomic resolution of the markers used (taxa were in fact identified at family level) and the preferential amplification of the most abundant taxa, such as species closely related to the peat bogs (e.g. Sphagnaceae, Ericaceae and Cyperaceae) or living at the time of sampling (e.g. Rotifera). The results were promising and led to the last study of the project based on paleoclimatic reconstructions of three peat bog sites (Tonale, Mortirolo and Vivione) located within the Adamello Park. The three sites were sampled in autumn 2020 and subjected to classical geochemical analyses such as water content and bulk density, and C/N ratio measurements. These results were then complemented by environmental DNA metabarcoding analyses of plants and invertebrates using the molecular markers ITS2 (Internal transcribed spacer 2) for plants, and another portion of CO1 gene with the improved taxonomic resolution, for invertebrates. The results allowed the identification of more taxa than in the previous study, such as several plant species belonging to the genus Carex, other than Nardus stricta, Eriophorum angustifolium, Trichophorum cespitosum, Potentilla erecta, and several invertebrate families such as Nothridae, Enchytraeidae, Isotomidae and Canthocamptidae. The Tonale and Mortirolo sites seem to be more influenced by climatic changes, and no direct impact from human activities were identified. The Vivione site, on the other hand, showed a strong alteration of all geochemical parameters and communities following the deposition of mineral layers most likely derived from percolations along the wall of the nearby mountain. The application of this approach allowed to highlight the changes mainly related to climate change. However, this approach did not identify forest or agriculturally related species, so human impacts on the surrounding environment, such as deforestation or establishment of food crops, cannot be excluded. Therefore, DNA metabarcoding is not able, for the moment, to provide a complete biological picture of peatland environments, but needs to be complemented by classical morphological analysis techniques. However, the results remain promising and indicate that the margins for improvement are wide.
Negli ultimi anni, attività umane e cambiamento climatico hanno causato forti impatti sui nostri ecosistemi. Questo ha favorito un sempre più crescente interesse verso studi in grado di determinare i possibili destini dei nostri. Generalmente, questi studi si basano sull'utilizzo di ecosistemi in grado di offrire una visione dei futuri scenari, partendo da dati basati sulle relazioni causa/effetto che gli ambienti hanno affrontato in diversi momenti della loro esistenza. Nonostante l'arco Alpino sia uno dei luoghi con la più alta biodiversità, nonché uno dei più impattati dal riscaldamento globale, pochi studi dedicati al destino dei suoi ecosistemi e delle comunità sono stati condotti. L'arco alpino è una delle aree più colpite dal riscaldamento globale. Ciononostante, sono stati condotti pochi studi paleoclimatici, principalmente nelle aree dei ghiacciai. Inoltre, questi studi si basano sull'identificazione morfologica dei residui organici che richiedono molto tempo e un'elevata competenza tassonomica. A questo proposito, qui proponiamo un approccio multi-proxy che include tecniche morfologiche e basate sul DNA per indagare le torbiere alpine e gli archivi paleoclimatici naturali. L'obiettivo di questa tesi è quindi duplice: i) valutare l'utilizzo di tecniche biomolecolari come il metabarcoding del DNA ambientale per l'identificazione tassonomica dei residui organici in ambienti torbosi, per ridurre i tempi di analisi e liberare questi studi dall'esperienza richiesta dall'identificazione morfologica; ii) eseguire le prime ricostruzioni paleoecologiche attraverso un approccio multi-proxy di tre siti torbosi situati nel Parco Naturale dell'Adamello. Per raggiungere questi obiettivi è stata effettuata una revisione della letteratura per descrivere le principali tecniche finora utilizzate, evidenziandone i limiti e descrivendo come le tecniche molecolari possano non solo aiutare a superare questi limiti ma anche come possano includere negli studi organismi esclusi dalle ricostruzioni paleoecologiche a causa di difficoltà nella loro identificazione. Successivamente, è stato condotto uno studio sperimentale per confrontare l'uso dell'approccio di metabarcoding del DNA con le classiche analisi geochimiche e morfologiche. L’analisi è stata effettuata su una carota proveniente da un sito di torbiera - Wölflmoor (Bolzano - Italia) - campionato nel 2017. L'introne cloroplastidiale trnL(UAA) e una porzione della subunità 1 della citocromo-c ossidasi (CO1), che possono amplificare il DNA di piante e invertebrati, rispettivamente, sono stati selezionati come marcatori molecolari. Inoltre, sono state condotte anche le classiche identificazioni morfologiche di 4 pollini, macro-fossili vegetali, amebe, e la misurazione della densità apparente, del contenuto di acqua e del rapporto C/N. I risultati ottenuti hanno evidenziato come l’analisi del DNA sia stata in grado di confermare le tendenze evidenziate negli altri proxies, presentando tuttavia delle limitazioni connesse alla risoluzione tassonomica dei marcatori usati (i taxa sono stati infatti identificati a livello di famiglia) e all’amplificazione preferenziale dei taxa più abbondanti, come specie strettamente legate alle torbiere (es. Sphagnaceae, Ericaceae e Cyperaceae) o viventi al momento del campionamento (es. Rotifera). I risultati sono stati comunque promettenti, e hanno condotto all’ultimo studio del progetto basato sulle ricostruzioni paleoclimatiche di tre siti di torbiera (Tonale, Mortirolo e Vivione) localizzati all’interno del Parco dell’Adamello. I tre siti sono stati campionati nell’autunno 2020 e sottoposti alle classiche analisi geochimiche quali misurazione di contenuto d’acqua e densità apparente, e misurazione del rapporto C/N. Questi risultati sono stati poi integrati da analisi di metabarcoding del DNA ambientale di piante e invertebrati tramite l’uso dei marcatori molecolari ITS2 (Internal transcribed spacer 2), per le piante, e di un’altra porzione della subunità 1 della citocromoc ossidasi (CO1) con una migliore risoluzione tassonomica, per gli invertebrati. I risultati ottenuti hanno permesso di identificare un maggior numero di taxa rispetto al precedente studio, come diverse specie di piante appartenenti al genere Carex, Nardus stricta, Eriophorum angustifolium, Trichophorum cespitosum, Potentilla erecta, e diverse famiglie di invertebrati come Nothridae, Enchytraeidae, Isotomidae e Canthocamptidae. Dai dati ottenuti, i siti del Tonale e del Mortirolo sembrerebbero essere maggiormente influenzati dal cambiamento climatico, e non sembrano aver subito impatti diretti dalle attività umane. Il sito del Vivione ha invece evidenziato una forte alterazione di tutti i parametri geochimici e delle comunità in seguito alla deposizione di strati minerali derivanti con molta probabilità da percolazioni lungo la parete della montagna vicina. L’applicazione di questo approccio ai tre siti ha permesso di evidenziare cambiamenti principalmente legati al cambiamento climatico. Tuttavia, questo approccio non ha identificato le specie forestali o legate all'agricoltura, quindi non si possono escludere possibili impatti umani sull'ambiente circostante, come la deforestazione o la creazione di colture alimentari. Pertanto, in DNA metabarcoding non è in grado, per il momento, di fornire un quadro biologico completo degli ambienti di torbiera, ma ha bisogno di essere integrata da tecniche classiche di analisi morfologica. Tuttavia, i risultati rimangono promettenti e i margini di miglioramento sono ampi.
In den letzten Jahren haben sich menschliche Aktivitäten und der Klimawandel stark auf unsere Ökosysteme ausgewirkt. Dies hat ein zunehmendes Interesse an Studien geweckt, mit denen das mögliche Schicksal unserer Ökosysteme bestimmt werden kann. Im Allgemeinen basieren diese Studien auf der Verwendung von Ökosystemen, die eine Perspektive für zukünftige Szenarien bieten können, ausgehend von Daten, die auf Ursache-Wirkungs-Beziehungen beruhen, denen die Umwelt in verschiedenen Momenten ihrer Existenz ausgesetzt war. Der Alpenbogen ist eines der Gebiete, die am stärksten von der globalen Erwärmung betroffen sind. Dennoch wurden einige wenige paläoklimatische Studien durchgeführt, vor allem in Gletschergebieten. Darüber hinaus basieren diese Studien auf der morphologischen Identifizierung organischer Rückstände, die zeitaufwändig ist und hohe taxonomische Fachkenntnisse erfordert. Vor diesem Hintergrund schlagen wir hier einen Multi-Proxy-Ansatz vor, der morphologische und DNA-basierte Techniken umfasst, um alpine Torfgebiete als natürliche paläoklimatische Archive zu untersuchen. Das Ziel dieser Arbeit ist daher ein zweifaches: i) die Evaluierung des Einsatzes biomolekularer Techniken wie DNA-Metabarcoding für die taxonomische Identifizierung organischer Rückstände in Torfgebieten, um die Analysezeit zu verkürzen und diese Studien von der Erfahrung zu befreien, die für die morphologische Identifizierung erforderlich ist; ii) die Durchführung der ersten paläoökologischen Rekonstruktionen durch einen Multi-Proxy-Ansatz für drei Torfgebiete im Adamello Naturpark. Um diese Ziele zu erreichen, wurde eine Überprüfung der Literatur durchgeführt, um die wichtigsten bisher verwendeten Techniken zu beschreiben, ihre Grenzen aufzuzeigen und zu beschreiben, wie molekulare Techniken nicht nur helfen können, diese Grenzen zu überwinden, sondern auch, wie sie Organismen in die Studien einbeziehen können, die aufgrund von Schwierigkeiten bei ihrer Identifizierung von paläoökologischen Rekonstruktionen ausgeschlossen wurden. Anschließend wurde eine experimentelle Studie durchgeführt, um die Anwendung des DNA Metabarcoding-Ansatzes mit den klassischen geochemischen und morphologischen Analysen zu vergleichen. Dazu wurde ein Bohrkern aus dem Wölflmoor (Bozen - Italien) untersucht, der im Jahr 2017 entnommen wurde. Als molekulare Marker wurden das chloroplastidial Intron trnL(UAA) und ein Teil der Cytochrom-c-Oxidase (CO1) -Untereinheit 6 1 ausgewählt, die jeweils pflanzliche und wirbellose DNA amplifizieren können. Darüber hinaus wurden die klassische morphologische Identifizierung von Pollen, Pflanzenmakrofossilien und Amöben sowie die Messung von Schüttdichte, Wassergehalt und C/N-Verhältnis durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass die DNA-Analyse in der Lage war, die in den anderen Proxies aufgezeigten Trends zu bestätigen, auch wenn es Einschränkungen in Bezug auf die taxonomische Auflösung der verwendeten Marker (Taxa wurden tatsächlich auf Familienebene identifiziert) und die bevorzugte Amplifikation der am häufigsten vorkommenden Taxa gab, wie z. B. Arten, die eng mit den Torfmooren verwandt sind (z. B. Sphagnaceae, Ericaceae und Cyperaceae) oder zum Zeitpunkt der Probenahme lebten (z. B. Rotifera). Die Ergebnisse waren vielversprechend und führten zur letzten Studie des Projekts, die auf paläoklimatischen Rekonstruktionen von drei Torfmooren (Tonale, Mortirolo und Vivione) im Adamello-Park basierte. Die drei Standorte wurden im Herbst 2020 beprobt und klassischen geochemischen Analysen wie Wassergehalt und Schüttdichte sowie C/N-Verhältnis-Messungen unterzogen. Diese Ergebnisse wurden dann durch Umwelt-DNA-Metabarcoding-Analysen von Pflanzen und Wirbellosen ergänzt, wobei die molekularen Marker ITS2 (Internal transcribed spacer 2) für Pflanzen und ein anderer Teil des CO1-Gens mit verbesserter taxonomischer Auflösung für Wirbellose verwendet wurden. Die Ergebnisse ermöglichten die Identifizierung von mehr Taxa als in der vorangegangenen Studie, z. B. mehrere Pflanzenarten der Gattung Carex, Nardus stricta, Eriophorum angustifolium, Trichophorum cespitosum, Potentilla erecta und mehrere Wirbellosenfamilien wie Nothridae, Enchytraeidae, Isotomidae und Canthocamptidae. Die Standorte Tonale und Mortirolo scheinen stärker durch klimatische Veränderungen beeinflusst zu sein, und es wurden keine direkten Auswirkungen menschlicher Aktivitäten festgestellt. Der Standort Vivione hingegen wies eine starke Veränderung aller geochemischen Parameter und Lebensgemeinschaften auf, die auf die Ablagerung von Mineralschichten zurückzuführen ist, die höchstwahrscheinlich aus der Versickerung an der Wand des nahe gelegenen Berges stammen. Die Anwendung dieses Ansatzes ermöglichte es, die hauptsächlich auf den Klimawandel zurückzuführenden Veränderungen aufzuzeigen. Allerdings konnten mit diesem Ansatz keine forst- oder landwirtschaftlich genutzten Arten identifiziert werden, so dass menschliche Einflüsse auf die Umgebung, wie etwa die Abholzung von Wäldern oder der Anbau von Nahrungsmittelpflanzen, nicht ausgeschlossen werden können. Daher kann das DNA-Metabarcoding derzeit noch kein vollständiges biologisches Bild der Moorlandschaften liefern, sondern muss durch klassische morphologische 7 Analyseverfahren ergänzt werden. Die Ergebnisse sind jedoch nach wie vor vielversprechend, und es gibt noch viel Spielraum für Verbesserungen.